Comparison of protective efficacy of Stx2eA toxoid with Salmonella ghosts carrying F18+STEC antigenic proteins against lethal challenge in the murine model

Article information

J. Prev. Vet. Med. 2019;43(1):19-25
Publication date ( electronic ) : 2019 March 31
doi : https://doi.org/10.13041/jpvm.2019.43.1.19
College of Veterinary Medicine, Chonbuk National University, Iksan campus, Gobong-ro 79 Iksan, 54596, Republic of Korea
Corresponding Author. John Hwa Lee, Tel: +82-63-850-0940, Fax: +82-63-850-0910, E-mail: johnhlee@jbnu.ac.kr
received : 2018 December 22, rev-recd : 2019 February 20, accepted : 2019 February 23.

Abstract

Shiga toxin 2e (Stx2e) has a pivotal role in the colonization and enterotoxicity of F18+Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), which causes porcine edema disease (ED). In this study, a Stx2eA mutant, which has a Glu167Gln mutation in Stx2eA that inactivates N-glycosidase activity, was genetically engineered to evaluate its potential immunogenicity and protective efficacy. A significant increase in serum IgG1 (a Th2 indicator) was shown in mice immunized with the mutated Stx2eA. However, only 56% of the mice immunized with the toxoid (5 μg) survived following a challenge with a lethal dose 50 (LD50) of a virulent F18+STEC strain (JOL654), while mice immunized with Salmonella ghosts delivering selected antigens of F18+STEC showed an 86% survival rate. The results suggest that sole use of the mutated Stx2eA toxoid may not be an effective preventive strategy for the control of porcine ED.

서 론

돼지 부종병 (Porcine Edema disease, ED)은 1938년 아일랜드에서 처음 그 존재가 확인된 후 장독소성 대장균 (Shiga toxin-producing E. coli, STEC) 에 의해 이유 후 7-10일내의 자돈 (8 - 16 주령) 에서 주로 발병하나 연령대에 상관없이 국내뿐 만 아니라 전 세계적으로 산발적인 발병이 보고되고 있다[12]. 감염돈 군에서는 15 - 30 %의 발병율을 보이며 90%가 넘는 사망률로 양돈 산업에 심각한 경제적 손실을 야기하고 있다. 100두 규모의 농장에서 부종병 발생시 대략 30%의 폐사율을 적용시 연간 2억원 정도의 피해가 발생된다고 추정되며, 이와 함께 폐사돈 처리 비용을 감안 시 피해는 더욱더 커질 것이라 예상된다 [10].

건강상태가 좋고 충분한 사료섭취를 하고 있는 돼지에서 갑작스러운 발생으로 이유 후 1-2주후에 자돈이 갑자기 폐사 하거나 눈 주위와 안면의 부종 근육의 진전과 간헐적 경련 등 신경증상을 보이며 신속히 폐사하는 것이 특징인 이 질병은 감별하기 쉬운 임상증상이 나타나지 않고 폐사된 후에 발견이 되는 경우가 대부분이다 [5]. 일반적으로 부종병 발생 농장은 임상증상이 나타나기 전부터 관련 장독소성 대장균의 배출이 폭발적으로 증가하는 경향을 보이며 동반되는 항생제 처치로 인해 실제로 감염 자돈에서는 그 병원성 대장균의 분리는 낮지만 동거축들은 꾸준히 분변으로 장독소성 대장균을 배출하기 때문에 항생제 치료 만으로는 치료효과를 기대하기 어렵다.

본 질병에 대한 예방 대책이 시급한 실정이지만, 국내에서 시판되고 있는 돼지 자가 대장균 증 백신은 대장균으로 인한 설사증을 예방하기 위하여 수동 면역 유도를 (passive immune response) 목적으로 모돈을 대상으로 하고 있으며 현재 돼지부종병을 예방하기 위해 상용화 되어진 백신은 없다. 또한 최근 돼지 설사의 주 원인 인 돼지 유행성 설사 (Porcine epidemic diarrhea, PED)의 백신효율의 저하로 인한 상재화와 사료내 항생제 금지 조치는 자돈과 모돈 의 면역력을 낮추고 있어 기존에 억제되어 왔던 세균성 질병에 의한 피해 우려가 높아지고 있는 실정이다.

본 질병의 원인균 인 돼지 장독소성 대장균 (porcine STEC)은 주요 발현 섬모군 (fimbriae) 에 따라 다섯가지 종류로 분류된다. 돼지에서 지금까지 알려진 ETEC의 주요 fimbria에는 K88(F4), K99(F5), 987P(F6), F41(F7), F18 이며 이들 섬모군 중 돼지 부종병을 일으키는 주요 섬모군은 F18로 알려져 있다[1]. F18 수용체 여분의 프롤린 단백질 (extra proline)의 유무로 인해 항원성의 차이가 결정되는 FedA 이형체 (variants) 에 따라 부종명을 일으키는 f18ab 섬모군과 이유후 설사와 관련이 있는 f18ac 섬모군으로 나누어 지는 본 병인체의 주요 병인성 인자는 부착인자 (adhesin)으로 작용하는 fimbriae (F18ab) 와 독소로 신경 증상과 부종증상을 일으키는 Shiga toxin 2e (stx2e) 이다 [2]. 체내에 들어온 세균은 돼지 소장 상피세포 brush border 에 있는 F18 수용체와 결합, 부착하여 집락화(colonization)을 시작하고 Stx2e 유전자의 발현으로 인한 shiga toxin 이 장 상피 세포에서 rRNA의 작용을 저해 함으로써 단백질 합성을 방해한다. 이는 혈액의 액상 성분이 조직으로 빠져나오게 만들어 부종을 일으키며, 또한 뇌압의 증가로 인한 신경증상의 발현을 초래한다. 독소의 중화에 작용하고 운동성 박테리아의 편모와 섬모에 특이적인 항체의 작용으로 미생물의 운동이 정지되어 조직표면에의 집락화를 막는 Immunoglobulin G (IgG) 의 역할이 본 질병의 예방을 위한 면역반응에 필수적으로, 백신에 의해 체액성 면역반응을 증진 시키는 Th2 기전의 유도가 무엇보다 중요하다 [12].

STEC는 생물학적 특성은 비슷하지만 다른 면역원성을 지니고 있는 Stx1와 Stx2로 구성되어있으며 한 개의 A subunit (Stx2eA) 과 다섯 개의 B subunit (Stx2eB)으로 구성되어 있는 Stx2e중, 본 연구 에서는 Stx2eA독소 단백질을 생산하는 Stx2eA 유전자를 돼지 부종병을 예방하기 위한 백신의 첫 번째 항원으로 선정 하였다 [9]. 대장균성 돼지 부종병 증상을 유발하는 직접적인 원인이 되는 독소인 Stx2eA 아형 단백질을 분리 정제한 톡소이드 백신의 면역원성 및 도전 감염에서의 방어력을 실험동물에서 관찰 하였다. 정제된 단백질을 화학적 면역증강제와 함께 직접 접종하면 높은 독소 중화항체가 유도되어 돼지 부종병의 발증을 예방하는 것이 가능하지만 독소의 안전성을 보장하기가 어렵다. 본 연구에서는 이를 방지하기 위하여 여러개의 단백질이 결합하여 독소를 발현하는 holotoxin인 Stx2eA subunit의 특성상, 생체내 안전성을 높이기 위하여 Stx2eA 아미노산 서열 번호 167의 글루탐산 (glutamate) 염기서열을 아스파르트산 (aspartate)으로 치환 후 합성하여 (point mutation), 본 변이 유전자를 cloning 한 단백질 발현 균주를 이용하여 Stx2eA 대장균 톡소이드(toxoid, inactivated bacterial toxin)를 준비하였다 [3]. 본 톡소이드의 생체내 독성 가능성을 평가하기 위해서 실험동물의 간 과 비장에서 면역화 전 후의 변화를 관찰 하였으며 효소면역정량분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 Th1 과 Th2 면역반응 지표로 사용되는 IgG1 및 IgG2a의 증감을 조사하였다. 또한 도전 감염 시 이전 연구에서 개발된 살모넬라 고스트를 이용한 돼지부종병 백신후보 균주에 면역화된 실험동물과 본 톡소이드 백신 후보주에 의해 면역화된 실험동물을 비교하여 상대적인 방어능력을 평가하였다[13].

재료 및 방법

동물 실험 윤리규정 Animals and ethics statement

모든 동물 실험은 2015년 한국 동물협회 및 동물 보호협회 지침에 따라 전북대학교 동물 윤리위원회 승인하에 진행되었다(CBNU2015-00085). 실험동물은 4 - 5 주령의 암컷 SPF BALB/c 마우스로 진행되었다. 실험동물은 온도와 습도가 유지되는 동물 사육장에서 사육되었고 항생제가 들어있지 않는 물과 사료를 자유배식하였다. 1케이지에 5마리의 마우스를 사육하였다. 실험동물 모니터링은 매일 2차례 진행 되었고 실험 종료시 표준 절차에 따라 고통을 최소한으로 하여 안락사를 진행하였다.

Stx2eA 톡소이드 발현 벡터의 구축 및 Stx2eA-His 발현 대장균의 제작

Stx2eA의 전구체를 코드하는 DNA 서열을 토대로 Stx2eA의 전구체를 코드하는 코돈의 일부를 개변하여 (Stx2eA 아미노산 서열 번호 167의 글루탐산 (glutamate) 염기서열을 아스파르트산 (aspartate)으로 치환 후 합성), 코돈을 최적화하고 발현 최적화하고, 발현 벡터로 클로닝하기 위한 5' 말단으로의 제한효소 EcoRI 인식 서열 및 3' 말단으로의 HindIII 제한효소 인식 서열을 부가한 DNA 서열을 설계하여 이를 인공 합성하였다 (Bioneer, Korea). 이 합성 유전자 cassette 은 시판되는 His-tag을 같이 발현 시키는 단백질 발현 벡터 pET32a (Novagen, USA)에 클로닝 되어 이를 pET28a-Stx2eA 가 제조 되었고, 본 플라스미드는 대장균 BL21(DE3)pLysS (Novagen, USA)로 형질전환 되어 Stx2eA-His 발현 대장균주 (JOL1902)를 얻었다. 본 단백질 발현균주는ampicillin (최종농도 200 ㎍/mL)를 첨가한 LB배지에서 배양 후 -80°C에서 20 % 글리세롤을 이용 보관 되었다. 본 연구에서 사용된 균주 및 plasmid 정보는 Table 1에 표기되었다.

Bacterial strains and plasmids used in this study

Stx2eA-His 발현 대장균주의 배양 및 Stx2eA-His의 정제

배양된 균액 중 250㎕를 각 항생제가 첨가된 새로운 5㎖ LB broth에 재접종하여 45분간 배양한 후 이중 1㎖는 유도 전 대조군으로 사용하기 위해 멸균 소형관 으로 옮겼다. 나머지 4mL에는 isopropyl-βD- thiogalactopyranoside (IPTG)의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 3시간 동안 배양한 후 이중 1㎖는 유도 후 발현 여부를 확인하기 위해 멸균 소형관에 옮겼다. 그리고 나머지 3㎖는 4,000×g에서 20분간 원심분리 한 후 멸균 phosphate buffered saline (PBS)500㎕로 재부유 하였다. 이를 초음파처리 (sonication)하여 cell을 분쇄한 다음 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액은 새로운 멸균 소형관에 옮기고 침전물 (pellet)은 500㎕의 멸균 PBS로 재부유하였다. 이들 상층액을 SDS-PAGE로 전기영동하여 단백질 발현 상태를 확인하였다.

Stx2eA-His 의 정제를 위하여 JOL1902 균주 colony를 LB broth 200㎖에 접종하여 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들어 주면서 하룻밤 배양하였다. 이 배양액에 IPTG의 최종농도가 1mM/ml이 되도록 첨가하여 같은 조건으로 4시간 재배양 하였다. 이 배양액을 8,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물은 phenyl methane sulfonylfluoride (PMSF)가 1mM이 되도록 첨가된 10㎖의 멸균 PBS로 재부유 시킨후 -70℃에서 냉동하였다. 2-3회 반복 후 부유액을 초음파 처리하여 cell들을 분쇄한 다음 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 멸균관에 옮겼다. Buffer B (100mM Nah2PO4,10mM Tris․Cl,8M urea, pH 8.0)4㎖를 상층액과 혼합하여 재부유 시킨 후 실온에서 1시간 동안 교반 하면서 반응시켰다. 이 반응액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심 분리한 후 resin이 들어 있는 관으로 옮겨 단백질이 resin과 결합하도록 30분간 교반 후 준비된 column에 충전시키고 천천히 흘려보내는 과정을 2-3회 반복 하였고 다음Buffer C (100mM Nah2PO4,10mM Tris․Cl,8M urea,pH 6.3) 6㎖로 column을 3회 세정하여 resin과 결합하지 않은 기타 불필요한 단백질을 제거하였다. Elution buffer (100mM Nah2PO4,10mM Tris․Cl,8M urea,pH 4.5) 2㎖로 column을 충전시킨 후 20분간 반응시켜 발현 단백질을 resin으로부터 분리시킨 다음 elution buffer를 1㎖씩 첨가하여 단백질을 회수하였다. 회수된 단백질은 체내 접종을 위하여 urea를 제거 하기 위하여 dialysis 과정을 거쳐서 준비 되었다. 정제된 Stx2eA-His 단백질은 12% SDS-PAGE에서 전기영동하여 확인되었으며 정량한 후 백신 접종시까지 -70℃에 보관하였다.

체액성 면역 반응 및 도전 감염시 방어능 평가를 위한 동물실험

총 35마리의 4주령 BALB/C 마우스를 각 그룹 당 7마리씩 5그룹으로 나누었고 A그룹은 비면역화 그룹으로 진행하였다. B와 C 그룹은 각각 1 μg 과 5 μg 의 정제된 Stx2eA-His 단백질을 Incomplete Freund's Adjuvant)(닛폰 벡톤 딕킨슨사)를 혼합하여 유화된 백신 후보주를 2주 간격으로 근육주사 하였다. 상대적인 면역 원성과 방어력을 평가하기 위하여 기존의 연구에서 그 면역성이 입증된 살모넬라 고스트를 이용한 돼지부종병 백신후보 균주에 Stx2eA-His 단백질 (5 μg)을 혼합하여 D 그룹 마우스에 근육 접종 하였고, E 그룹 마우스에는 살모넬라 고스트를 이용한 백신 균주를 단독 근육 접종 하였다. 살모넬라 고스트를 이용한 돼지부종병 백신후보 균주들 (JOL1454, JOL1460, JOL1464, JOL1485) 의 준비 및 접종 용량 및 경로 (총 1 ⅹ108 CFU, 근육주사) 는 기존의 연구 실험 과정을 따랐다 [11]. 면역 후 Stx2eA toxoid 로 면역화된 마우스에서 IgG subgroup 의 증감을 관찰 하기 위해서 A 와 C 그룹의 혈청이 0, 2 4 주차에 채취되었다. 혈청은 안와 후 정맥을 통해 채취 한 후 4,000g, 5분 동안 원심 분리하여 상등액 의 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관한 후 실험에 사용하였다.

방어능력 측정을 위해 백신 접종 4주후 실험 동물을 대상으로 전북의 한 양돈 농장에서 분리된 돼지에서 분리된 STEC 야외균주 (JOL654)로 도전 감염을 실시하였다. 도전 감염 균주는 PCR을 이용해 Stx2e, F18ab, LT, STa 유전자를 확인하였고 Lethal dose50(LD50)는 실험동물에 야외균주를 106 cfu/ml 부터 108cfu/ml까지 Intraperitoneal 접종을 통해 생존확율을 계산 후 Reed-Muench 방법을 통하여 2 x 107 cfu/ml로 결정되었다. 도전 감염 후 50 시간 동안 설사, 폐사와 같은 임상 증상을 확인하였다.

체내 독성 실험

정제된 Stx2eA-His 의 체내 안전성을 평가 하기 위해서 20μg을 Balb/c mice (5주령, female)에 복강으로 0주차 1회 접종한 후 마우스를 (그룹당 4마리) 희생시켜 비장과 간의 변화를 대조군과 비교, 관찰 하였다. 또한 접종 후 염증 사이토카인 (IL-8, TNF-α)의 체내 발현을 확인하기 위하여 채취된 비장을 분쇄하고 조직 내 세포를 꺼내 cell stainer로 남은 조직을 제거하였다. 원심분리하여 세포를 가라앉힌 뒤 RPMI(모든 RPMI (RPMI 1640 supplemented. Sigma)는 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 IU/ml penicillin 그리고 100ug/ml streptomycine이 포함되어 있다.)로 부유시켜 재차 cell을 centrifuge로 가라앉힌 뒤 RBC Lysis buffer통해 cell을 부유시켜 RBC를 제거 하였다. 염증성 사이토카인 분석을 위하여 RNeasy plus mono kit (Qiagen사)를 사용하여 splenocyte로부터 total RNA를 추출하였다. 추출 된 total RNA는 NanoDrop를 이용하여 적절한 농도값을 확인한 뒤 cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems) 이용하여 cDNA로 합성 후 각 염증성 사이토 카인의 primer pair 를 사용하여 [7], Quantitect SYBR Green PCR mastermix (catalogue no. 204143;Qiagen, CA)로 IL-8, TNF-α, β-actin의 증폭 정도를 Real time PCR (Step One plus Real Time PCR system, Applied Biosystems)을 사용하여 mRNA 레벨에서 관찰 하였다.

면역화된 마우스의 체액성 면역 반응

Stx2eA에 반응하는 IgG1, IgG2a 항체를 측정하기 위해 ELISA를 시행하였다. 수행 방법은 접종량을 결정짓기 위한 Sample well에는 정제된 항원 단백질을 500ng/well의 농도로, standard well에는 goat anti-mouse IgG, IgG1, IgG2a 또는 goat anti-mouse sIgA를 각각 200ng/well의 농도로 분주 한 후 4℃에서 하룻밤 동안 coating하고, Coating 된 plate는 Tween 20이 0.05% 함유된 PBS (PBST)로 3번 washing 한 후 blocking buffer (3% skim milk in PBS) 로 blocking 한 다음 serum은 PBST로 1:100으로 Fecal은 1:3로 각각 희석한 다음 100 ㎕씩 well에 분주한 후, 37℃에서 1시간30분 동안 반응. Serum의 경우 peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG1, peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG2a 에 각각 반응 시킨 후 HRP를 1:5,000의 배율로 희석하여 각 well에 100μ씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응. OPD-substrate 반응액을 well 당 100μl씩 분주하여 발색 후 3M H2SO4로 stop후 492nm에서 OD값을 측정하였다.

통계분석

모든 데이터는 평균±표준 편차(SD)로 표시되었다. SPSS 버전 16.0 소프트웨어 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석을 수행했다. Mann-Whitney U test는 immunized group과 unimmunized control group 사이의 면역 반응과 기관 세균분리의 통계적 차이를 분석하는데 사용되었다. P 값이 0.05 이하일 때 그 차이가 유의한 값으로 결정했다 (P < 0.05).

결 과

Stx2eA의 대장균 주에서 발현 여부 확인

부종병을 유도하는 독소 Stx2eA을 클로닝한 pET32a-stx2eA 벡터를 형질 전환시킨 대장균 주 JOL1902에서 유도되는 독소의 발현을 확인하였다. 단백질 발현을 유도하는 IPTG 가 첨가된 배지에서 자란 JOL1902 균주 에서 단백질 과발현이 유도되었고 정제된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 확인 되었다. 과발현 배양액의 세포 파쇄 후에 Buffer B 와 혼합하여 column에 흘려보낸 샘플을 (flow-through, FT) 대조군으로 사용하였다 (Lane FT, Fig. 1). 또한 Elution buffer 로 column resin에 결합된 his-tag 과 동시에 발현된 정제된 Stx2eA (~32.2 kDa)의 크기 또한 SDS-PAGE에서 확인되었다 (Lane stx2eA, Fig. 1).

Fig. 1.

15% SDS-PAGE analysis of mutated Stx2eA protein expressed in JOL1902 (~32.2kDa) M, Marker; FT, Flow-through.

체내 독성 실험

본 연구에서는 돼지 부종병을 일으키는 주요 독소인 Stx2eA의 enzymatic activity등의 독성을 줄이기 위하여 mutated 된 Stx2eA-His 단백질을 정제하여 면역화에 사용하였다. 본 백신주의 안전성을 체내에서 검증하기 위하여 독소단백질을 마우스의 복강에 접종 1주일 후 비장과 간을 분리하여 형태의 변화를 관찰하였고 또한 체내 염증성 사이토카인의 증감을 확인하였다. 접종 1주일후 사망한 실험동물은 없었으나, 비장의 종대 및 간의 미세한 울혈이 관찰되었다 (Fig. 2). 실험동물에서 분리한 splenocytes를 각각의 항원 단백질로 자극 후 RT- PCR 을 이용하여 유전자 증폭에 의한 형광 물질 증폭을 이용하여 주요 염증성 사이토카인인 IL-8과 TNF-α 의 발현을 측정 하였다 [6]. Fig. 3C 에서 나타나듯이 대조군과 비교하여 면역화된 실험 동물에서 통계적으로 유의한 정도의 증가는 관찰 되지 않았다 (P = 0.238). 본 실험 결과는 mutated Stx2eA 가 체내에서 치명적인 독성의 증가 및 염증 반응을 유도하지 않았다는 것을 나타내며 안전성을 확보했다는 것을 보여준다.

Fig. 2.

A. Representative images of the enlarged spleens (2, 3 and 4) found in the mice injected with the toxoid vaccine candidate, compared with the negative control (1) B. Congested and enlarged livers found in the mice injected with the toxoid vaccine candidate (2 and 3), compared with the negative control (1) C. Cytokine assay in splenocytes. The mRNA transcript levels of inflammatory cytokines, IL-8 and TNF-α were evaluated in splenocytes isolated from the mice immunized with the toxoid vaccine candidate by performing RT PCR. The values of the relative fold change of each group were expressed as the mean ± standard deviation (s.d.). NC, Negative control.

Fig. 3.

Assessment of serum IgG1 and IgG2a antibody responses against Stx2eA toxoid in immunized mice measured by ELISA. NC, Negative Control; *, P < 0.05.

체액성 면역반응 유도 확인

IgG항체의 아형인 IgG1 과 IgG2a 항체는 각각 T-helper cell 2 (Th2) 및 Th1 면역 반응의 주요 반응 지표 (indicator)로 널리 사용 되어 지고 있다 [8]. 본 연구에서도 point-mutation 된 stx2eA 독소 단백질이 체내에서 세포성 면역유도와 관련된 Th1 면역반응, 또한 체액성 면역 유도와 관련된 Th2 면역 반응을 자극하는지 여부를 ELISA를 통해 분석하였다. Fig. 3에서 나타나듯이 면역화된 마우스의 혈청에서 마지막 백신접종 2주후에 대조군과 비교하여 유의하게 증가한 IgG1 항체의 양을 나타내는 O.D 값을 확인 할 수 있었지만 이에 반해 IgG2a 항체가는 면역화 후 관찰 기간 동안 유의한 증가세가 보이지 않았다 (Fig. 3). 이 결과는 본 mutated Stx2eA 접종 시 체내에서 체액성 면역 반응을 자극 시킬 수 있는 가능성을 시사한다.

도전감염 시 방어능력 확인

Stx2eA 톡소이드의 방어능력을 확인하기 위하여 부종병 감염목적 동물에서 분리한 야외 균주 JOL654를 이용한 도전 감염시험을 실시하였으며 상대적인 방어능력을 관찰하기 위하여 기존에 개발된 살모넬라 고스트를 이용한 돼지 부종병 백신 후보주로 면역화된 실험 동물에서도 같은 방식으로 도전 감염이 진행되었다. Fig. 4에서와 같이 동일한 투여경로로 백신 투여시 백신비접종 군과 B군 (toxoid 1ug 투여) 에서는 백신의 방어효과를 관찰 할 수 없었고, Toxoid 용량을 높인 C군에서는 약 56%의 생존율 (4/7) 을 관찰 할 수 있었다. 반면에 고스트 백신 투여군인 D군과 E군에서는 약 86% (6/7) 의 생존율을 보였다. 특히 D군에서 toxoid 의 추가 접종에도 불구하고 고스트 단독 투여군인 E 군과 비교시 그 효과의 증가를 관찰할 수 없었다.

Fig. 4.

Protective efficacy of immunization with the vaccine candidates against a lethal challenge with an LD50 concentration of the virulent F18+STEC strain JOL654.

고 찰

돼지 부종병을 야기하는 F18+STEC 의 Stx2e 단백질에서 소장 상피세포 표면의 globoriaosylceramide (Gb4) 수용체와 결합하여, 세포독성을 야기하는 Stx2eA의 발현을 도와주는 homo pentamer Stx2eB 부분을 항원으로 한 백신 연구는 꾸준하게 진행 되어왔다 [9]. 하지만 Stx2eB의 중화항체를 이용하여 Gb4 수용체와의 결합을 저해하여 독소 발현을 초기에 차단한다는 단독방어전략은 그 효용성을 높이기 위하여 다른 부착인자등의 항원과 같이 사용 될 때 향상된 방어능력을 나타냈다 [11]. 본 연구에서는 돼지 부종병 병인기전에서 주요 독소 단백질인 Stx2eA를 돼지 부종병 예방 백신 후보주의 항원으로 사용 후 면역 원성 및 도전감염시 방어능력을 조사 하였다. 여러 개의 단백질이 결합하여 독소를 발현하는 holotoxin인 A 부분의 세포독성을 완화시키기 위하여 point-mutation 된 Stx2eA toxoid를 정제 분리하기 위하여 단백질 발현 벡터 및 균주를 사용하여 분리, 정제가 이루어졌다 (Fig. 1). 정제된 toxoid 의 잔여 세포 독성을 확인하기 위하여 실험동물 투여 1주일 후에 나타나는 비장 및 간 등의 장기 변화와 비장세포에서 발현되는 주요 염증성 사이토카인 IL-8과 TNF-α 의 증가를 확인 하였다. IL-8은 비만세포, 중성구 등에서 생성되 어 염증반응에서 백혈구에 대한 화학주성인자(chemokine) 로 작용하며 TNF-α는 병원성 자극에 의해 유도되는 염증반응에 관여하는 주요 인자로 알려져 있다 [6]. 비장종대 및 미세한 울혈이 간에서 관찰되었으나, 미미한 염증성 사이토카인의 변화를 감안시 독성 보다는 백신 접종으로 인한 외부 항원 체내 진입시 나타나는 일시적인 변화일 가능성을 제기 할 수 있다. 또한 본 toxoid 접종시 실험동물에서 유의하게 증가하는 IgG1 항체가가 확인 되었으며, IgG1 항체가 Th2 면역유도 지향성 체액면역반응의 유도를 지시한다는 것을 고려할 때 실험 동물에서 독소 중화항체 형성의 가능성이 제시 되었다. 하지만 실험 동물에서 진행된 조사임을 고려하여 목적 동물에서 vero cell을 이용한 중화항체 시험 등을 통해 생성 되는 항체의 역할을 확인 할 필요가 있을 것 이다. 하지만 이러한 세포독성의 완화와 기대되는 면역원성의 발현에도 불구하고 야외균주 JOL654를 이용한 도전감염 실험에서 용량에 따라 생존율의 차이를 보였다. 1μg의 toxoid로 면역화된 실험 동물은 control 그룹과 같이 도전 감염 후 30시간 내에 모두 폐사 하였고 5μg의 toxoid 로 면역화된 실험 동물은 약 56%의 생존율을 보여, Salmonella ghost 를 이용한 돼지 부종병 백신 후보주에 면역화된 실험 동물에 비교하여 낮은 생존율을 나타냈다.

기존의 연구에서 개발된 F18+ 대장균의 주요 항원을 선정하여 항원을 효과적으로 발현시킬 수 있는 고스트 백신 시스템은 용해(lysis) 유전자에 의해 유도되는 세포막의 구멍 발생에 의해 세포의 빈껍질만 남는 상태인 살모넬라 균주는 용해과정 동안 실활되지 않기 때문에 주요 면역 자극 요소가 그대로 보존되며 이는 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)으로 작용하여 특이적으로 체액성 및 세포매개성 면역을 유도하기 때문에 고스트 살모넬라 균주 자체가 돼지부종병 예방을 위한 면역반응을 증강 시킬 수 있도록 디자인이 되어있다 [11]. 이러한 실험 결과를 고려할 때 F18+STEC 감염 예방을 위해 주요 독소인 Stx2eA에 대한 방어 또한 중요하지만 전반적인 병인기전, 즉 병원체 침입 후 소장 상피세포 brush border에 있는 F18 수용체와 결합, 부착하여 집락화 (colonization)을 시작하고 Stx2e 독소의 발현 등의 과정을 순차적으로 방어 할 수 있는 전략이 필요함을 나타내며, 목적동물의 전반적인 면역기능 향상에 초점을 둘 수 있는 백신의 개발이 시급함을 시사한다.

References

1. Duan Q, Zhou M, Liang H, Zhu X, Guo Z, Li Y, Hardwidge PR, Zhu G. Contribution of flagellin subunit FliC to piglet epithelial cells invasion by F18ab E. coli. Vet Microbiol 2013;166:220–224.
2. Fekete PZ, Gerardin J, Jacquemin E, Mainil JG, Nagy B. Replicon typing of F18 fimbriae encoding plasmids of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli strains from porcine postweaning diarrhoea and oedema disease. Vet Microbiol 2002;85:275–284.
3. Gordon VM, Whipp SC, Moon HW, O’Brien AD, Samuel JE. An enzymatic mutant of Shiga-like toxin II variant is a vaccine candidate for edema disease of swine. Infect Immun 1992;60:485–490.
4. Hur J, Lee JH. A new enterotoxigenic Escherichia coli vaccine candidate constructed using a Salmonella ghost delivery system: Comparative evaluation with a commercial vaccine for neonatal piglet colibacillosis Vet Immunol Immunopathol; 2015. 164p. 101–109.
5. Marques LRM, Peiris JSM, Cryz SJ, O’brien AD. Escherichia coli strains isolated from pigs with edema disease produce a variant of Shiga-like toxin II. FEMS Microbiol Lett 1987;44:33–38.
6. Mogensen TH. Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses. Clin Microbiol Rev 2009;22:240–273.
7. Overbergh L, Valckx D, Waer M, Mathieu C. Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR. Cytokine 1999;11:305–312.
8. Oyama N, Sudo N, Sogawa H, Kubo C. Antibiotic use during infancy promotes a shift in the TH1/TH2 balance toward TH2-dominant immunity in mice J Allergy Clin Immunol; 2001. 107p. 153–159.
9. Sato T, Matsui T, Takita E, Kadoyama Y, Makino S-I, Kato K, Sawada K, Hamabata T. Evaluation of recombinant forms of the shiga toxin variant Stx2eB subunit and non-toxic mutant Stx2e as vaccine candidates against porcine edema disease J Vet Med Sci; 2013. 75p. 1309–1315.
10. Seo BJ, Jeong CG, Kang AR, Cho HS, Kim WI. Evaluation of the virulence genes and Shiga toxin-producing abilities of Escherichia coli field isolates causing edema disease in pigs. Korean J Vet Serv 2016;39:87–92.
11. Won G, John Hwa L. Potent immune responses induced by a Salmonella ghost delivery system that expresses the recombinant Stx2eB, FedF, and FedA proteins of the Escherichia coli -producing F18 and Shiga toxin in a murine model and evaluation of its protective effect as a porcine vaccine candidate. Vet Q 2017;37:81–90.
12. Won G, Lee JH. Multifaceted immune responses and protective efficacy elicited by a recombinant autolyzed Salmonella expressing FliC flagellar antigen of F18+Escherichia coli. Vaccine 2016;34:6335–6342.
13. Won G, Lee JH. F18+ Escherichia coli flagellin expression in Salmonella has immunoadjuvant effects in a ghost vaccine candidate containing E. coli Stx2eB, FedF and FedA against porcine edema disease. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2018;58:44–51.

Article information Continued

Fig. 1.

15% SDS-PAGE analysis of mutated Stx2eA protein expressed in JOL1902 (~32.2kDa) M, Marker; FT, Flow-through.

Fig. 2.

A. Representative images of the enlarged spleens (2, 3 and 4) found in the mice injected with the toxoid vaccine candidate, compared with the negative control (1) B. Congested and enlarged livers found in the mice injected with the toxoid vaccine candidate (2 and 3), compared with the negative control (1) C. Cytokine assay in splenocytes. The mRNA transcript levels of inflammatory cytokines, IL-8 and TNF-α were evaluated in splenocytes isolated from the mice immunized with the toxoid vaccine candidate by performing RT PCR. The values of the relative fold change of each group were expressed as the mean ± standard deviation (s.d.). NC, Negative control.

Fig. 3.

Assessment of serum IgG1 and IgG2a antibody responses against Stx2eA toxoid in immunized mice measured by ELISA. NC, Negative Control; *, P < 0.05.

Fig. 4.

Protective efficacy of immunization with the vaccine candidates against a lethal challenge with an LD50 concentration of the virulent F18+STEC strain JOL654.

Table 1.

Bacterial strains and plasmids used in this study

Strain/plasmid Description Reference/source
Bacterial strains
E. coli
 BL21(DE3)pLysS F- ompT hsdSB (rB- mB-) dcm galλ(DE3) pLysS Cmr Promega
 JOL654 Wild-type LT+,F18+,STa+, stx2+, stx2e+ STEC isolate from pig Lab stock
 JOL1902 BL21(DE3)pLysS harboring pET32a-stx2eA This study
S. Typhimurium
 JOL912 Δlon ΔcpxR Δasd, a derivative of S. Typhimurium [4]
 JOL 1454 JOL912 harboring pJHL184-stx2eB [11]
 JOL 1460 JOL912 harboring pJHL184-FedF [11]
 JOL 1464 JOL912 harboring pJHL184-FedA [11]
 JOL 1485 JOL912 harboring pMMP184-fliC [12]
Plasmids
 pET32a IPTG-inducible expression vector; Kmr Novagen
 pET32a-stx2eA pET28a derivative containing stx2eA This study
 pJHL184 asd+ vector, pBR ori plasmid carrying ss ompA/His6, multiple cloning site, cI857/λ PR promoter, araC ParaBAD, phiX174 lysis gene E [4]
 pJHL184-stx2eB pJHL184 harboring stx2eB gene [11]
 pJHL184-fedA pJHL184 harboring FedA gene [11]
 pJHL184-fedF pJHL184 harboring FedF gene [11]
 pJHL184-fliC pJHL184 harboring fliC gene [12]